一、環(huán)境要求
PCR的特點(diǎn)決定了進(jìn)行反應(yīng)的唯一DNA必須是實(shí)驗(yàn)者所加的模板，所以PCR應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。在醫(yī)學(xué)上，當(dāng)診斷涉及倫理道德方面的疾病時(shí)，可能還會(huì)遇到糾紛和官司。在進(jìn)行食品的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)時(shí)，由于污染可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的檢測(cè)報(bào)告。
污染問題和進(jìn)行無污染PCR所要求的潔凈度之間的關(guān)系被比喻成操作病原體與好的微生物技術(shù)之間的關(guān)系，與微生物技術(shù)不同的是，“生物危害”主要是對(duì)PCR而非操作者本人。因而這種干凈的環(huán)境是任何以PCR為基礎(chǔ)的分析系統(tǒng)所需要的，不管其處理的樣品數(shù)量如何。
二、污染的來源
PCR可從痕量的DNA擴(kuò)增出大量的DNA產(chǎn)物使得PCR特別容易受到污染，主要是由于操作時(shí)產(chǎn)生氣溶膠而引起的。污染的DNA可能有3個(gè)來源：一是來自其它測(cè)試樣品的DNA；二是來自試驗(yàn)材料如重組克隆的DNA；三是來自同一靶序列前一次PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，這種污染通常稱為“遺留”污染，是最為麻煩的一種。
三、控制污染的方法
1.分區(qū)控制污染 把PCR實(shí)驗(yàn)室的各部分在區(qū)域上分為樣品制備、前PCR區(qū)和后PCR區(qū)。在不同的地點(diǎn)進(jìn)行PCR的目的是為了避免污染，即舊的PCR產(chǎn)物在對(duì)新的PCR分析的污染、分子克隆的污染和樣品與樣品之間的污染。將PCR過程的各部分在區(qū)域上分開需要額外的空間、資金和設(shè)備，但這一方法應(yīng)該是任何污染控制策略的核心部分，必須進(jìn)行資金等投入。
2.UNG控制污染使用尿嘧啶DNA-糖苷酶(UNG)，并用脫氧尿苷三磷酸(dUTP) 代替脫氧胸苷三磷酸(dUTP)。 其做法是將所有的擴(kuò)增反應(yīng)與UNG酶進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，可以去除殘留在DNA中的dU(但不影響DNA、gUTP 或RNA)，產(chǎn)生數(shù)十或數(shù)百的無堿基位點(diǎn)，DNA聚合酶會(huì)在這些位點(diǎn)處停滯。而且這些位點(diǎn)是不穩(wěn)定的，在熱循環(huán)中會(huì)發(fā)生斷裂，每一種損傷都會(huì)防止重?cái)U(kuò)增的發(fā)生。PCR產(chǎn)物越長(zhǎng)，UNG去污染的效率就越高，但對(duì)短于100bp的PCR產(chǎn)物不能用UNG完全消除污染。
3.紫外線控制污染用紫外線使干燥的DNA失活以減少器材表面模板DNA污染的手段，機(jī)理是通過在相鄰的嘧啶堿基之間形成環(huán)丁烷而造成DNA損傷，環(huán)丁烷環(huán)形成鏈內(nèi)的嘧啶二聚體，從而抑制了聚合酶介導(dǎo)的鏈延伸反應(yīng)。其缺陷是不能消除所有污染，而只能將污染降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)，并且當(dāng)DNA片斷小于300bp時(shí)效果較差。另外象加樣器、離心機(jī)等器材只有一小部分是向著光源的，這樣就不能被紫外線有效地去除污染。因而，紫外線照射僅可以為保持PCR實(shí)驗(yàn)室的無污染提供額外的安全保障。
四、PCR 實(shí)驗(yàn)室各區(qū)的預(yù)防措施
1.樣品準(zhǔn)備區(qū)這個(gè)區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準(zhǔn)備，所有的樣品都帶進(jìn)這個(gè)區(qū)域處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應(yīng)采取以下預(yù)防措施：
(1)實(shí)驗(yàn)者在任何時(shí)候都應(yīng)該穿實(shí)驗(yàn)服和戴手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在DNA抽提過程中每1步之間都要更換。實(shí)驗(yàn)服要專門用于樣品準(zhǔn)備間，并經(jīng)常清洗；
(2)只要能夠得到可靠的結(jié)果，提取和純化模板的方法越簡(jiǎn)單越好；
(3)要使用新鮮配制的或適當(dāng)儲(chǔ)存的未使用過的試劑或緩沖液來提取核酸，不要用以前用于別的樣品的試劑；
(4)用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用于操作靶序列；
(5)DNA樣品應(yīng)該用有專門防護(hù)或正活塞式加樣器，以防止在吸取樣品時(shí)有氣溶膠的產(chǎn)生遺留；
(6)大體積樣品應(yīng)該用單獨(dú)包裝的無菌一次性加樣器吸取；
(7) Eppendorf 管盡量用進(jìn)口的，在打開之前都要經(jīng)短時(shí)離心(約10s)，并用正確的手法緩慢打開，而不能用力崩開，以減少和避免氣溶膠的產(chǎn)生；
(8) PCR產(chǎn)物和帶有擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個(gè)區(qū)域操作；
(9)最好在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪設(shè)1次性臺(tái)布，用完后丟棄；
(10)實(shí)驗(yàn)完畢應(yīng)打開紫外線燈照射30min以上。
2.前PCR區(qū)此區(qū)域是專門用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)的區(qū)域。
(1)如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部有合成引物或探針的能力，則引物的合成和純化都應(yīng)在遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的其它專門區(qū)域進(jìn)行；
(2)用于操作引物的加樣器應(yīng)該是專用的并得到妥善保管。如引物被模板DNA污染，則這種污染不可能去掉，且經(jīng)濟(jì)損失也是較大的，并會(huì)導(dǎo)致假陽性的結(jié)果；
(3)此區(qū)域的實(shí)驗(yàn)服是專用的，不能用于其它區(qū)域；
(4)如果是1個(gè)人負(fù)責(zé)全部的實(shí)驗(yàn)，則實(shí)驗(yàn)者不能從此區(qū)域重新回到樣品準(zhǔn)備區(qū)，而只能從此區(qū)域到后PCR區(qū)作單方向的移動(dòng)。
3.后PCR區(qū)
(1)此區(qū)域使用的所有試劑、一次性器材和儀器都必須是專門用于這一目的，絕不能用于任何前PCR活動(dòng)的區(qū)域； .
(2)前PCR區(qū)與后PCR區(qū)應(yīng)沒有試劑和人員的混雜，實(shí)驗(yàn)者不能從此區(qū)域進(jìn)人到前PCR區(qū)；
(3)在此區(qū)域建立適當(dāng)?shù)呐棚L(fēng)裝置看來是必要的；
(4) PCR儀的位置看來是個(gè)小問題，但該儀器如有包括進(jìn)行污染非敏感型的多種用途，折衷的辦法是將儀器放在后PCR 區(qū)。
五、其它措施
1.保證高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)用水 所有配制PCR試劑使用的水應(yīng)該是新鮮蒸餾的去離子水，用0.22pm濾膜過濾的，并且經(jīng)高壓滅菌，儲(chǔ)存過久的水應(yīng)避免使用，認(rèn)為購買的蒸餾水是干凈的觀點(diǎn)是錯(cuò)誤的。純水的制備應(yīng)在沒有DNA污染的其他實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，如化學(xué)實(shí)驗(yàn)室等。如果實(shí)驗(yàn)室用水或純水機(jī)被污染，則對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)是致命的。
2.手套的使用在配制試劑、操作樣品、建立反應(yīng)和檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的全部過程中，都要戴手套并勤于更換，以避免核酸和核酸酶的污染；
3.正確的試劑配制與貯存使用的試劑應(yīng)是“分析純”以上、正規(guī)廠家生產(chǎn)和從正規(guī)渠道購買的，以避免重金屬離子、核酸酶和其它非特異污染物的引入。所有的試劑應(yīng)以大體積、高濃度(如10x、50x等)來配制，然后稀釋和分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存，以保證實(shí)驗(yàn)的連續(xù)性和避免污染。
4.加樣器的妥善保管應(yīng)準(zhǔn)備多支加樣器以用于不同的PCR的操作，雖然這樣會(huì)增加成本投入，但卻是減少污染的有效辦法；樣品準(zhǔn)備區(qū)和前PCR區(qū)使用的加樣器在不使用時(shí)，將其保存在密封袋中是防止加樣器污染的1種有效方法。
5.設(shè)立對(duì)照 應(yīng)設(shè)立陽性、弱陽性和陰性對(duì)照。使用陽性對(duì)照時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格避免由對(duì)照引起的污染；使用弱陽性對(duì)照的目的是驗(yàn)證各種反應(yīng)緩沖液中含擴(kuò)增抑制物；陰性對(duì)照則要與每組樣品同時(shí)做，以分析是否存在樣品與樣品和PCR產(chǎn)物的污染，陰性對(duì)照應(yīng)包括除模板以外的所有試劑。
6.器材的處理所有試劑和樣品準(zhǔn)備過程中都使用1次性滅菌的瓶子和管子。一些較貴重的需要復(fù)利用的器材，如玻璃器皿，必須經(jīng)強(qiáng)酸處理后，再經(jīng)170℃，2h的干烤處理。某些認(rèn)為125℃高壓處理能夠破壞模板DNA的想法和做法是不可靠的。
7.風(fēng)淋 的使用如果把組織培養(yǎng) 或微生物操作的標(biāo)準(zhǔn)無菌技術(shù)用于PCR，如風(fēng)淋的使用，則污染的風(fēng)險(xiǎn)將大大降低，但這無疑要大大增加成本的投入。
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